Будь умным!


У вас вопросы?
У нас ответы:) SamZan.ru

Депарафинизация среза- 1

Работа добавлена на сайт samzan.ru: 2016-06-20


Протокол метода “TUNEL”  (ApopTag Fluorescein in situ Apoptosis Detection kit,

S7110, Chemicon International) для парафиновых блоков

1. Депарафинизация среза:

1.1. 3 смены ксилола по 5 минут;

1.2. 2 смены абсолютного этанола по 5 минут;

1.3. 1 смена 95% этанола и 1 смена 79% этанола по 3 минуты;

1.4. 1 смена PBS по 5 минут.

2. Предобработка среза:

2.1. на срез нанести 15 мкл раствора протеиназы К (предварительно готовится stock solution: 5 мг/мл протеиназы К в PBS, который разливается по аликвотам (по 10 мкл) и замораживается; при использовании этот раствор разводится до концентрации 20 мкг/мл в PBS (разведение 250 раз: 2 мкл stock solution + 498 мкл PBS);

2.2. инкубировать срез 15 минут при комнатной температуре во влажной камере;

2.3. промыть срез 2-мя сменами PBS по 2 минуты.

3. Добавление эквилибрационного буфера:

3.1. осторожно удалить остатки PBS со среза;

3.2. немедленно добавить 15 мкл Equilibration buffer на срез;

3.3. инкубировать срез не менее 10 секунд при комнатной температуре.

4. Добавление TdT фермента:

4.1. осторожно удалить остатки буфера со среза;

4.2. немедленно нанести на срез 15 мкл рабочего раствора TdT (предварительно смешать в эппендорфе 42 мкл Reaction buffer и 3 мкл TdT , хорошо перемешать на вортексе, полученный раствор может храниться в холодильнике не более 6 часов, этого количества достаточно для 3-х срезов);

4.3. инкубировать во влажной камере в термостате при +37оС 1 час.

5. Добавление останавливающего буфера:

5.1. поместить срез в рабочий раствор Stop/Wash Buffer (предварительно смешать в пластиковой пробирке (на 50 мл) 1 мл Stop/Wash Buffer и 34 мл дистиллированной воды, полученный раствор может храниться в холодильнике до 1 года (аликвотировать!);

5.2. прополоскать срез в растворе 15 секунд;

5.3. инкубировать срез в растворе 10 минут при комнатной температуре.

6. Достать из пробирки Anti-Digoxygenin conjugate (18 мкл) и оставить в эппендорфе согреваться до комнатной температуры в темноте.

7. Добавление Anti-Digoxygenin conjugate:

7.1. промыть срез в 3-х сменах PBS по 1 минуте;

7.2. осторожно удалить остатки PBS со среза;

7.3. добавить 15 мкл рабочего раствора Anti-Digoxygenin conjugate (предварительно смешать в эппендорфе в темноте 27 мкл Blocking Solution и 18 мкл подогретого до комнатной температуры (п.7) Anti-Digoxygenin conjugate, тщательно перемешать на вортексе, до использования хранить в темноте в холодильнике не более 3 часов) – полученного количества достаточно для 3 срезов;

7.4. инкубировать во влажной камере 30 минут при комнатной температуре в темноте.

8. Промывка срезов:

8.1. промыть срез в 4-х сменах PBS по 2 минуты при комнатной температуре в темноте.

9. Контр-окрашивание и монтирование:

9.1. добавить на срез монтирующую жидкость, содержащую 0,5-1,0 мкп/мл пропидия йодида, по 15 мкл на срез (прим. на 3 среза 3-5 мкл ПЙ и 40-42 икл монтирующей жидкости);

9.2. накрыть срез покровным стеклом;

9.3. микроскопировать.




1. Деловое общение- спор
2. 2 Кейс Анализ фотографии рабочего времени В ходе анализа деятельности предприятия было выявлено чт
3. Особливості грошового обігу під час Першої світової війни
4. ТЕМА- ЗАВИСИМОСТЬ ЦЕНЫ И СПРОСА Преподаватель- Кондратенко Н
5. украинизации Сущность политики украинизации- на руководящую работу назначали представителей корен
6. 31з Прізвище ім~я побатькові залікової кн
7. Тема- Створення звітів за допомогою СУБД ccess Мета- Набути навичок створення звітів
8. Тема- Характеристика периода новорожденности План лекции Внутриутробный период
9. то разНочной поройКогда в лесу так тихоВстречают волка под горойЗайчата и зайчиха
10. это технологии мультимедиа
11. Тема 4 Факультет военного обучения Ростовского Государственного Университета Кафедра связ
12. Тема 9. Профессиональная и организационная адаптация персонала
13. Бизнес план диспетчерской службы такси ldquo;под ключrdquo; за 5 15 тыс
14. Wht mkes good communictor doesn~t rmbler; doesn~t digress too often; long digressions doesn~t interrupt; doesn~t get e
15. Відкритого Кубка Звягеля Zvygel Cup з жиму лежачи та становій тязі 15.html
16. Информационные ресурсы современного общества
17. 16 вв Образование единого Русского государства нашло своё яркое воплощение вкультурнобытовом облике стра
18. Анна, жена Иоанна III Ватаца, и ее время.html
19. Концепция развития расчетной сети Банка России утв
20. Тема- Генеалогический метод